一文读懂 PROTAC 降解剂的靶点和组织选择性

　　可成药的靶标相当有限，因为大约 85% 的蛋白质没有适合小分子结合的功能性结合位点。

　　当前，靶向蛋白质降解 (TPD) 策略已彻底改变了传统的对某些靶标不可成药的观点。由于抑制选择性和化合物对特定组织及细胞类型的靶向等因素，许多被寄予希望的小分子抑制剂在对蛋白质功能的干预和抑制方面都显得一筹莫展。PROTAC（蛋白水解靶向嵌合体）和分子胶技术的优点是可实现对靶点抑制的高度选择性。多项研究表明，PROTACs能够最终靠优化连接链的类型和长度来形成稳定的三元复合物。由于 PROTAC 的双功能特性，可通过 E3 连接酶的组织选择性来揭示新的靶向机制。 本文对选择性的 PROTAC和新型PROTAC 技术的最新进展进行了总结与分析，并展望了基于选择性PROTAC的未来发展趋势。

　　根据PROTAC 的在线数据库(PROTAC-DB)显示，目前已经开发了2258 个 PROTAC，以针对 124 个不同的 POI。这些分子由 275 个 POI 结合配体与 68 个 E3 连接酶配体连接而成（图 1B）。在 124 个 POI 中，研究最多的靶标是：雌激素受体 (ER)、雄激素受体 (AR)、BTK、ALK、BCR-ABL 和 BRD4，基于这一系列靶标开发的 PROTAC占总数的近 30%（图 1B ）。 其中有两个靶标（ER 和 AR）的PROTAC已确定进入了2 期临床试验，分别是ARV-110 和ARV-471 。从 E3 连接酶的角度来看，在 600 多种可能用于 TPD 的 E3 连接酶中（图 1C）。目前绝大多数 PROTAC 仅使用两种E3连接酶：CRBN（1363 个 PROTAC）和 VHL（733 个 PROTAC）。此外，已经开发了基于连接酶 IAP 和 MDM2 的E3连接酶配体的 PROTAC，但是这些数量并不多（124 个基于 IAP 和 20 个基于 MDM2 的 PROTAC，如图1C所示）。目前科学家们也在致力于发现新的E3连接酶。 在过去的二十年里，研究人员一直在致力于开发不一样的种类 POI 的 PROTAC分子。然而，对于如何通过合理的 PROTAC 设计实现目标和组织选择性的降解仍然是重大挑战。这一挑战的解决对于充分的发挥 PROTAC 和 TPD 作为治疗方式的潜力至关重要。

　　Crews 实验室做了一系列的开创性工作，探讨了配体结合选择性与降解选择性的有关问题。研究之后发现，目标 POI 的选择性降解不一定与目标配体结合选择性或亲和力相关。例如，多靶点的激酶抑制剂 foretinib，该抑制剂在 10 μM 时可结合超过 130 种激酶。可一旦转化为双功能分子，这些基于foretinib的 PROTAC 便仅显示与 54 种靶激酶结合。 靶头抑制剂和招募的 E3 连接酶之间的最佳配对对目标POI 降解至关重要。他们将三种 BCR-ABL 酪氨酸激酶抑制剂（伊马替尼、波舒替尼和达沙替尼）与已知的 VHL 和 CRBN 结合配体结合，设计并合成了几种 BCR-ABL PROTAC，通过配对不同的靶头和 E3 连接酶来比较靶降解曲线。根据结果得出，招募达沙替尼 CRBN 的 PROTAC (DAS-6-2-2-6-CRBN) 可以降解 cABL 和 BCR-ABL，而任何 VHL-ABL 均未见 BCR-ABL 降解。然而，当用配体 bosutinib 取代达沙替尼时，招募 VHL 的 PROTAC 不能降解任何蛋白质靶标。因此，常常要评估多个目标 POI 配体、E3 连接酶配体和接头，以实现靶蛋白的降解选择性。

　　研究表明，使用的特定 E3 连接酶如何对 PROTAC 活性和选择性具有重大影响。 首先，一些激酶，例如 MAP3K11 和 src，显示出相似的连接酶偏好。CRBN 和 VHL配体与三种不同的激酶靶向支架配对的比较表明：VHL 配体可以靶向 CRBN 的 PROTAC 未靶向的另外16 种激酶，这表明增加E3连接酶配体的多样性能增加靶标的数量。 其次，使用 CDK4/6 抑制剂 palbociclib 对四种不同 E3 连接酶的系统探索表明，降解的选择性主要是通过基于 VHL 而不是 CRBN、MDM2 、IAP 的 PROTAC实现的（图 2B）。 此外，研究人员探索了PROTAC 对 HDAC 家族蛋白的降解选择性。作者设计合成了基于泛 HDAC 抑制剂（dacinostat）合成了与三种不同 E3 连接酶配体（CRBN、VHL 和 IAP）配对的降解剂，并评估了几种 HDAC 蛋白家族成员的降解。他们发现降解选择性通常与使用的特定 E3 连接酶有关。例如，基于 CRBN 的 dacinostat PROTAC 优先降解 HDAC6 和 HDAC8，而 IAP 招募化合物显示出对 HDAC6 的选择性降解。 因此，PROTAC 设计中使用不相同的E3 连接酶配体能够在一定程度上促进降解选择性，特别是在没有选择性结合配体的大型蛋白质家族的情况下。

　　从三元复合物（BRD4-MZ1-VHL，PDB 5T35 ） 的晶体结构发现PROTAC 诱导的靶蛋白和 E3 连接酶之间的静电表面相互作用对稳定三元复合物具备极其重大作用。协同性 ( α ) 已定义为 PROTAC 结合的二元和三元复合物解离常数之比 ( α = K d (二元)/ K d (三元))。它可以是正数 ( α 1)，负数 ( α 1) 或中性 ( α = 1)，具体取决于目标 POI 和 E3 连接酶之间相互作用的有利程度。 一般来说，目标 POI 和 E3 连接酶之间有利的蛋白质-蛋白质相互作用导致正协同性 ( α 1)，而负协同性 ( α 1) 则不利于三元复合物的形成。有必要注意一下的是，协同性对“钩子效应”有显着影响，高浓度的PROTAC与有效的三元配合物竞争，从而以浓度依赖性方式降低降解效力（图 3B）。 虽然慢慢的变多的研究表明协同性是驱动选择性靶标降解的重要的条件，但也有一些例外的情况显示实现有效的蛋白质降解并不是特别需要从根本上的正向协同性。 例如，几个基于 CRBN 的 BTK PROTAC 具有相对较长的连接链，即使具有中性协同性 ( α = ∼1) ，也显示出有效的 BTK 降解活性 (DC 50 = 1–40 nM )。此外，基于 CRBN 的 BRD4 PROTAC (dBET23) 具有负协同性 ( α = 0.4)，却表现出 BRD4 的有效降解活性 (DC 50 = ∼50 nM)。因此，尽管积极的协同性通常与目标降解相关，这并非是绝对必要的。此外，重要的是要注意协同性和三元复合物的形成也可能受到细胞中靶标、E3 连接酶和 PROTAC 的绝对浓度的影响。另一个考虑因素是高度稳定的三元复合物可能会产生一定的副作用，因为它可能会阻止有效的催化循环。因此，简单地基于协同性优化 PROTAC 可能并不总是理想的。

　　蛋白质降解是细胞途径的核心调控过程。根据编码序列的特定特性，蛋白质半衰期的可能从几分钟到几天不等。这些差异是由于泛素-蛋白酶体系统成员和自噬的特定相互作用而产生的，而自噬是蛋白质消除的主要途径。确定目标 POI 对 TPD 是否适用的最重要的条件是了解其在相关细胞类型和疾病状态的内在降解和合成。如前文所述，蛋白质周转率 (PTR) 是预测有效 PROTAC的给药方案的参数。在 PROTAC 降解目标 POI 并从动物体内清除后如果目标 POI 的合成速度很快，功能可能会很快恢复。理论上由PROTAC 降解的蛋白质的合成率可能与基础稳态条件下的蛋白合成率不匹配，因为细胞内存在代偿机制。 有必要注意一下的是，如果降解的蛋白质在合成速率上有差异，人类能利用这些合成差异来设计PROTAC 分子。并且蛋白质半衰期并不总是与特定目标 POI 的可降解性相关。因此，长时间暴露的 PROTAC 的选择性可能低于暴露时间短的 PROTAC。此外， PK-PD建模降解和细胞反应可能在实现必要的功效和保持充足的靶标选择性以避免毒性方面发挥关键作用。

　　PROTAC 目标选择性的另一个考虑因素是 PROTAC 有可能促进与目标 POI 相关的临近蛋白质的泛素化。对于多组分蛋白质复合物中存在的目标 POI 尤其如此。据报道，靶向 EED 的 PROTACs 是表观遗传调控多梳抑制复合物 2 (PRC2) 的核心亚基，不仅会降解 EED，还会降解 PRC2 复合物的 EZH2 和 SUZ12 成分。因此，需要仔细考虑旁观者降解是否是 PROTAC 参与一个复杂蛋白的直接结果，因此导致泛素分子转移到目标 POI 和其他相关蛋白。这可能特别具有挑战性，因为通常一个复杂蛋白的降解会导致化学计量失衡，使得复合物中的其他蛋白质被细胞的蛋白质质量控制机制降解。在任何情况下，当 PROTAC 目标 POI 是多亚基复合物的一个组成部分时，应考虑旁观者泛素化，并且根据上下游信号通路的变化判断该降解是积极还是消极的结果。

　　PROTAC 富有吸引力的另一特点是能利用E3 连接酶的组织特异性来驱动特定细胞类型、组织类型和疾病状态的目标蛋白选择性降解。这种方法有可能提高PROTAC的治疗指数。

　　癌细胞中过度表达的连接酶不是专注于组织或细胞类型，而是为选择性降解提供了另一种途径。TCGA 和 DEPMAP 数据能结合起来，进一步探索哪些连接酶在某些环境中过度表达，以及哪些连接酶对癌细胞增殖至关重要。组织选择性 PROTAC 开发最成功的例子之一是 BCL-xL PROTAC。BCL-xL 是一种经过充分验证的癌症靶点，但传统的 BCL-xL 抑制剂（如 ABT263）显示出靶向性、剂量限制性血小板毒性。 为减少这样的一种情况的发生，人们开发了一种 BCL-xL PROTAC (DT2216)，它通过招募 VHL E3 连接酶来靶向 BCL-xL 进行降解。研究之后发现 DT2216 对各种 BCL-xL 依赖性白血病细胞系更有效。最重要的是，它对血小板的毒性比 ABT263 低得多，因为 VHL 在血小板中的表达最低。这些发现证明了使用 PROTAC 有降低靶向药物毒性的潜力。

　　一个领域的发展得益于新技术，这些新技术大大改善了PROTAC的选择性与降解活性。然而，这些技术也同样面临许多问题：不同细胞类型中的活性 E3 连接酶是什么？如何利用它们选择性降解新的底物？如何扩展 PROTAC 化合价以实现更高的特异性？如何在不进行大量化学合成活动的情况下用计算机模拟实现选择性？

　　E3 连接酶活性的方法是使用光激活 ABP，用于具有不一样 E3 激活机制的 RING E3 连接酶。工程化的 E2∼Ub 缀合物被设计成具有非不稳定的赖氨酸异肽键，取代了硫酯泛素键，并在泛素本身上引入了光交联基团（图 9B）。这使作者能够捕获 RING 连接酶的活性复合物，如 RNF4，并且他们推测将这些技术与质谱法相结合可拿来分析某些细胞类型中治疗性连接酶。 由于连接酶具有多亚基复杂结构，因此评估 cullin-RING 连接酶的活性也带来了挑战。了解哪些 cullin 连接酶具有活性的一种方法是研究组装到这些复合物中的接头的化学计量。 Deshaies 实验室在两项具有里程碑意义的研究中率先采用该技术来了解 CRL1 和 CRL4 复合物的活性。为了测量不同 CRL 复合物的丰度，他们开发了一种称为蛋白质相互作用动力学和化学计量估计 (PIKES) 分析的定量蛋白质组学技术（图 9C ））。这种方法需要在“分子海绵”存在的情况下对 cullins 进行内源性标记和免疫沉淀，以防止在此过程中发生适配器交换。他们发现 CRL4 连接酶复合物的底物受体占有率变化高达 200 倍。重要的是，同源 PROTAC 底物受体的更高组装可以显着提高降解效力。将此应用于其他 cullins 和细胞类型可能会揭示复杂组装中的重要差异，这些差异不能仅由 mRNA 或蛋白质水平决定。该方法极大让我们对组织和细胞特异性连接酶的理解，并推动连接酶在 PROTAC 开发中的设计。

　　分子建模将降低选择性测定的障碍，并成为化学和 E3 连接酶生物学之间的重要桥梁。三元结构建模的最新进展推进了计算机 PROTAC 设计的快速发展。传统的 PROTAC 建模方法最初集中在将 PROTAC 对接到一种蛋白质的口袋中，选择特定的构象或对接姿势，然后将另一种蛋白质叠加到复合物上。后来基于 Rosetta 的建模已应用于 PROTAC 设计，并且诸如 PROsettaC 之类的工具已经可用。所有这一些方法都使用已知的晶体结构和对接配体，通常侧重于接头优化以实现最低能量构象。这些模型可用于研究 PROTAC 对紧密关联蛋白质的选择性并解释活性的差异。 许多组织选择性连接酶的结构是未知的，这妨碍了我们对其生物学的理解以及在 TPD 方法中的应用。Alphafold技术能在没有结构信息的情况下研究具有连接酶和靶蛋白的三元复合物。在使用 PROTAC 和连接酶/靶蛋白对三元复合物建模后，Alphafold 预测可以进一步探索表面暴露的赖氨酸的保守性以及紧密关联的连接酶或靶标之间的蛋白-蛋白相互作用。Alphafold有助于进行广泛的筛选以寻找新化学实体，并提供有关目标和连接酶的易处理性和配体性的信息。

　　可成药的靶标相当有限，因为大约 85% 的蛋白质没有适合小分子结合的功能性结合位点。目前为止，药物发现还严重依赖于传统的小分子抑制，因此大多数蛋白质都是难以成药的。TPD能够最终靠降解致病靶蛋白而发挥治疗作用，它的出现彻底改变了药物开发的格局。PROTAC 介导的降解已扩展到多种靶蛋白，目前的研究方向是怎么样产生特异性小分子以实现靶点和组织选择性。在特定的组织和细胞类型中靶向 POI 降解能大大的提升治疗系数。TPD 未来的另一个重要挑战是使用的 E3 连接酶的范围。人体中可能有超过 600 种 E3 连接酶，但目前只有非常有限的 E3 连接酶可用于PROTAC设计。 因此，扩展 E3 连接酶以做到合理的 PROTAC 设计将很重要，这不但可以增加可靶向蛋白的数量，还能大大的提升靶向的选择性。通过利用组织选择性连接酶和其他靶向方法，包括光诱导的时空可控 PROTACs 和组织可递送抗体介导的 PROTACs，PROTACs 的治疗指数将继续提高。 然而，挑战与机遇并存。开发识别目标 POI 和 E3 连接酶的非功能性配体是未来研究趋势。靶蛋白配体是 PROTAC 开发的重要组成部分。E3 连接酶本身是难以获得结合剂的蛋白，许多与疾病相关的 POI 可能没办法与之连接。因此，随着对PROTAC的理解不断深入，挑战可能会转向识别非功能性配体。未来研究方向主要聚焦于靶蛋白配体的发现，高通量筛选、DNA 编码文库筛选和全面的化学蛋白质组学等技术将逐步推动PROTAC领域不断前进。

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