神经环路运用（32）丨条件性敲除要害基因技能

　　条件性敲除要害基因技能（尤其是依据 Cre-loxP 体系）已成为神经环路研讨的中心东西，它能够在必定程度上完结对特定脑区、特定细胞类型或特定发育/行为时刻窗中方针基因的精准失活，然后解析该基因在神经环路结构与功用中的效果。

　　Cre（Cre重组酶）是酪氨酸位点特异性重组酶（T-SSRs）宗族的一员，该宗族还包含Flp（翻转酶）和Dre（D6特异性重组酶）。Cre开始是在噬菌体P1中发现的，由cre（cyclization recombinase，环化重组酶）基因编码，发生一种分子量为38 kDa的DNA重组酶。Cre能够辨认特定的DNA序列oxP（locus of x-over, P1）位点并介导两个loxP位点之间DNA片段的位点特异性删去。loxP位点是一段34 bp的DNA序列，由两个13 bp的反向重复且呈回文结构的臂和中心8 bp的中心序列组成。

　　Cre-loxP 体系是哺乳动物基因修改中大规模的运用的一项强壮技能，其长处是操作简略快捷、重组效率高且无需额定辅助因子就能够完结高效DNA重组。该体系的中心机制是：单个 Cre 重组酶可辨认两个同向摆放的 loxP 位点，并切除两者之间的 DNA 片段（即“floxed”序列），由此发生一个环状的游离 DNA 和一条缺失方针基因 Y 的染色体，使该基因失活。除了删去，Cre-loxP 还可依据 loxP 位点的相对方向和方位，介导 DNA 的倒位或易位。

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　　1. Cre 驱动小鼠：在特定安排或细胞类型中表达 Cre 重组酶（由安排特异性发动子控制）；

　　经过将两种小鼠杂交，可在特定细胞中完成基因 Y 的条件性敲除。重组的空间特异性由发动子/增强子决议，时刻特异性则取决于 Cre 表达的时刻窗口。

　　为完成更准确的时空调控，研讨者开发了药物诱导型 Cre 体系，如 CreERT（也称 Cre-ERT）。

　　CreERT 是将 Cre 与骤变型雌激素受体配体结合域（ER-LBD）交融而成；在无诱导剂时，CreERT 与热休克蛋白 HSP90 结合，停留于细胞质；当给予组成类固醇（如他莫昔芬tamoxifen或其活性代谢物 4-OHT）后，HSP90 解离，CreERT 转位入核辨认 loxP 位点并发动重组。CreERT2其对 4-OHT 的敏感性比原始 CreERT 高约 10 倍，因此在体内试验中更为常用。

　　（B）运用loxP和Cre驱动小鼠品系构建条件性骤变的惯例繁育战略：原则上，一只小鼠需带着安排特异性发动子驱动的Cre基因，另一只小鼠则带着方针基因Y两边被loxP序列“围住”（即“floxed”）的等位基因。Cre重组酶的表达会切除floxed区域，然后使基因Y失活。

　　在无 Tam 时，CreER 交融蛋白与热休克蛋白 90（HSP90）结合，停留于细胞质中（1）；

　　给予 Tam 后，Tam 与雌激素受体（ER）结构域结合，损坏 CreER 与 HSP90 的相互效果（2）；

　　在核内，CreER 辨认 loxP 位点（4），切除 floxed 区域，然后在特定安排 X 中使方针基因 Y 失活（5）。

　　运用广泛性或安排特异性发动子驱动 rtTA（反向四环素调控转录激活因子）表达；

　　无 Dox（强力霉素）时，rtTA 处于非活性状况，无法结合 cre 基因上游的 tetO7（含7个19 bp tetO 序列的最小发动子，也称 TRE）；cre 不表达；

　　无 Dox 时，tTA（四环素调控转录激活因子）处于活性状况，可结合 tetO7 发动子，驱动 cre 表达；

　　给予 Dox 后，Dox 与 tTA 结合使其失活，无法结合 tetO7，cre表达被封闭，重组中止。

　　他莫昔芬诱导的 CreERT 体系经过控制 Cre 入核完成时刻精准调控；而 Tet-on/off 体系则经过 Dox 控制 cre 基因的转录开关。两者均可与安排特异性发动子联用，完成对基因功用在特定细胞、特定时刻的精准控制，已成为神经科学、发育生物学和疾病建模等范畴的中心技能。

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